و هدف ……………………………………………………………………………………………….0

فصل دوم: کلیات و مروری بر منابع موجود

1-2- کلیاتی در مورد سویه های تولید کننده شیگاتوکسین ((STEC اشریشیاکلی………………….5

1-1-2- وروتوكسین ها یا توكسین های شبیه شیگا  …………………………………………………………..5

2-1-2-  ژنتیک وروتوكسین    ………………………………………………………………………………………7

3-1-2- ساختمان وروتوكسین ها  ………………………………………………………………………………….8

4-1-2- ناهمگونی سویه های تولید کننده شیگاتوکسین   ………………………………………………….10

5-1-2- نامگذاری سویه های تولید کننده شیگاتوکسین  …………………………………………………..11

6-1-2-  اپیدمیولوژی پاتوتیپ تولید کننده شیگاتوکسین…………………………………………………..12

7-1-2- منابع انتشار سویه های تولید کننده شیگاتوکسین ………………………………………………….

15 2-2- کلیاتی در مورد بلدرچین  ………………………………………………………………………..16

1-2-2- تاریخچه  ……………………………………………………………………………………………………..17

2-2-2-  شروع پرورش در جهان   ……………………………………………………………………………….17

3-2-2- شروع پرورش در ایران  ………………………………………………………………………………….18

4-2-2- جانور شناسی  ……………………………………………………………………………………………….19

5-2-2- نژادهای بلدرچین  ………………………………………………………………………………………….19

6-2-2- ویژگیهای عمومی بلدرچین  …………………………………………………………………………….21

7-2-2- جنبه های اقتصادی………………………………………………………………………………………….24

8-2-2- نکاتی در مورد شروع صنعتی پرورش  ……………………………………………………………….25

9-2-2- وسایل مورد نیاز برای نگهداری جوجه های بلدرچین   …………………………………………28

10-2-2- تغذیه بلدرچین  …………………………………………………………………………………………..30

11-2-2-  فراوری و بسته بندی گوشت و تخم بلدرچین ها   ……………………………………………..32

3-2- کلیاتی در مورد بیماری های بلدرچین   ………………………………………………………………….34

1-3-2- کلی باسیلوز در بلدرچین و طیور  ……………………………………………………………………..35

2-3-2- اشکال دیگر کلی باسیلوز در طیور  …………………………………………………………………..41

3-3-2- بیماری نیوکاسل  …………………………………………………………………………………………..42

4-3-2 -آنفلوانزا ……………………………………………………………………………………………………….45

5-3-2- برونشیت بلدرچین ………………………………………………………………………………………….46

6-3-2- بیماری آسپرژیلوز ………………………………………………………………………………………….50

فصل سوم: مواد  و روش کار

1-3- مواد و وسایل مورد استفاده  …………………………………………………………………………………54

2-3- روش‌کار  ………………………………………………………………………………………………………..55

1-2-3- جمع آوری و تقسیم بندی نمونه‌ها  ……………………………………………………………………55

2-2-3- كشت نمونه‌ها و جدا سازی اشریشیاکلی  ……………………………………………………………55

3-2-3- تأیید نمونه‌های اشریشیاکلی   …………………………………………………………………………..56

4-2-3- ذخیره نمونه‌ها  ………………………………………………………………………………………………56

5-2-3- آزمایش PCR  …………………………………………………………………………………………….57

1-5-2-3- استخراج DNA  ………………………………………………………………………………………57

2-5-2-3- آزمایش PCR جهت شناسایی ژنهای کد کننده شیگا توکسین و انتیمین   ……………57

3-5-2-3-  آزمایش PCR جهت تعیین گروه و تحت گروه فیلوژنی  …………………………………59

4-5-2-3-  شناسایی و آنالیز محصولات PCR  ……………………………………………………………..61

1-4-5-2-3- مراحل انجام الکتروفورز  …………………………………………………………………………61

3-3- تعیین حساسیت آنتی‌بیوتیكی  ………………………………………………………………………………64

فصل چهارم: نتایج

1-4- تعیین درصد جدایه های اشریشیاکلی در گروه های فیلوژنی   …………………………………….67

2-4- انتشار جدایه ها از مدفوع بلدرچین در تحت گروه های فیلوژنی  …………………………………68

3-4- نتیجه آزمایش PCR جهت شناسایی ژن های eae ، stx1 وstx2  ……………………………70

4-4- انتشار فیلوژنی جدایه های اشریشیاکلی مثبت از نظر stx1 ،eae و stx2   ……………………71

5-4- تعیین حساسیت آنتی بیوتیکی جدایه ها  …………………………………………………………………73

فصل پنجم : بحث و نتیجه گیری

نتیجه گیری …………………………………………………………………………………………………………….. 76

پیشنهادات  …………………………………………………………………………………………………………………..

منابع …………………………………………………………………………………………………………………….83

خلاصه انگلیسی  …………………………………………………………………………………………………..90

باکتری اشریشیاکلی بطور معمول در دستگاه گوارش PESTAN(به خاطر محدودیت سایت در درج بعضی کلمات ، این کلمه به صورت فینگیلیش درج شده ولی در فایل اصلی پایان نامه کلمه به صورت فارسی نوشته شده است)داران و پرندگان وجود دارد.سویه های بیماریزا، در شرایط استرس محیطی و تضعیف سیستم ایمنی باعث ایجاد کلی‌باسیلوز[1] در طیور می‌شوند. سویه های بیماریزا همچنین باعث ایجاد بیماریهای گوارشی و عفونت دستگاه ادراری در انسان می شوند. سویه‌های بیماریزای اشریشیاکلی طیور[2]‌‌‌‌ (APEC) بصورت عادی جزء میكروفلور طبیعی دستگاه گوارش طیور می‌باشند و ممكن است در سطوح مخاطی حیوانات اهلی و وحشی نیز یافت شوند

خرید اینترنتی فایل متن کامل :

 

 

. حدود 10 تا 15 درصد از کلی‌فرم[3]‌‌های روده، مربوط به سروتیپ‌های بیماریزا[4] می‌باشد. می‌توان سروتیپ‌های بیماریزا را همراه با سروتیپ‌های غیر بیماریزا[5] از محیط اطراف طیور جدا كرد. عفونت با سویه‌های APEC غالباً با عفونت‌های خارج گوارشی به ویژه عفونت‌های تنفسی و یا سیستمیک همراه است.

می باشند. اخیرا مشخص شده که این سویه ها ممکن است در دامها و طیور سالم هم حضور داشته باشند. مهمترین عامل بیماریزایی این سویه ها، تولید شیگاتوکسین است که از مدفوع طیور و حیوانات سالم به محیط ،آب و غذا منتقل شده و باعث بیماری در انسان می گردد. سویه های STEC قادرند دو نوع شیگاتوکسین Stx1   و Stx2  را تولید نمایند. مطالعات  اندکی در زمینه سویه های STEC جدا شده از طیور ، انجام شده است. از طرف دیگر  آنالیز فیلوژنتیکی باکتری اشریشیاکلی نشان داده است که سویه های مختلف این باکتری در 4 گروه فیلوژنتیکی شامل A ,B1 B2 , وD  قرار دارند.

 از آنجائیکه تاکنون مطالعه فیلوژنتیکی بر روی سویه های اشریشیاکلی STEC جدا شده از بلدرچین وجود ندارد، لذا هدف از انجام این پایان نامه جدا سازی اشریشیاکلی از مدفوع
بلدرچین های سالم و شناسائی سویه های واجد  ژن های کد کننده شیگا توکسین و انتیمین
 (Stx1 و  (eae_, Stx2 و  تعیین گروه فیلوژنتیکی اشریشیاکلی به روش PCR می باشد.

1-2 کلیاتی در مورد سویه های تولید کننده شیگاتوکسین [7]((STEC اشریشیاکلی

کشف پاتوتیپ اشریشیاکلی های تولید کننده  شیگا توکسین (STEC) از زمانی آغاز شد که گروهی از دانشمندان گزارش کردند که مایع فیلتر شده ی کشت تعدادی از سویه های مختلف اشریشیاکلی برای سلولهای ورو[8]  سایتوتوکسیک کشنده بوده و این فعالیت کشندگی سلول با آنتی سرم انتروتوکسین  [9] اشریشیاکلی های شبه کلرای کلاسیک خنثی نمی شد. متعاقباً آنالیز 136 سویه  اشریشیاکلی آشکار ساخت که 10 مورد از این سویه ها قادر به تولید این سیتوتوکسین سلول های ورو [10]هستند. بعد از اخذ این نتایج، اهمیت حضور سویه های اشریشیاکلی O26  تولید کننده سیتوتوکسین درارتباط با اسهال خونی مشخص شد در سال 1983 ارتباطی بین یک سروتیپ نادر از اشریشیاکلی (O157:H7) والتهاب کولون خونریزی دهنده [11]  گزارش شد. در همان سال گروهی از محققین ارتباط بین حضور شیگاتوکسین تولید شده توسط اشریشیاکلی و بروز سندرم یورمی انسان را مطرح کردند. این مشاهدات باعث توجه قابل ملاحظه ای به پاتوتیپ STEC شد و از آن زمان  تاکنون بیش از 200 تیپ مختلف اشریشیاکلی گزارش شده اند که شیگاتوکسین تولید می کنند و تعداد زیادی از آنها با بیماری های انسان ارتباط دارند(4)

1-1-2 وروتوكسین ها یا توكسین های شبیه شیگا

از نظر تاریخچه در سال 1977 كنوالجوك[12] ، كلمه وروتوكسین را برای سیتوتوكسین اشریشیاكلی بكار برد در یک مطالعه كه برروی 136 سویه اشریشیاكلی انجام گرفت، 7 مورد از 10 سویه ای كه وروتوكسین تولید می كردند با بیماری اسهال انسانی و یک مورد از آنها با اسهال خوكها ارتباط داشتند. در یک مطالعه مقدماتی در سال 1977 و مورد كامل آن در سال 1982، گزارش گردید كه سویه های خاصی از ETEC، سیتوتوكسینی را تولید می كنند كه برای سلولهای هلا[13] كشنده است همانند توكسین شیگا این سیتوتوكسین نیز از سنتز پروتئینی در سلول های هلا ممانعت می كند و از طرف دیگر در روده خرگوش اثرات آنتروتوكسیک داشته و برای موش نیز كشنده است، به همین دلیل این سیتوتوكسین را توكسین شبیه شیگا نام نهادند. در سال 1983 SLT خالص گردید و نشان دادند كه توكسین شیگا تولید شده بوسیله شیگلادیسانتریه و SLT تولید شده بوسیله اشریشیاكلی ازنظر خصوصیات فیزیكوشیمیایی و فعالیت های بیولوژی مشابهند (22).

 2-1-2 ژنتیک وروتوكسین

در ابتدا مشخص گردید كه ژنهای وروتوكسین ها مربوط به باكتریوفاژهای معتدل[14] بوده و متعاقب آن ژنهای SLT-I این باكتریوفاژها كلون گردید و توالی نوكلئوتیدهای آن تعیین شد اپرن SLT-I، دوچارچوب خواندن[15] را شامل می شود كه یكی برای كد كردن تحت واحد A و دیگری برای تحت واحد كوچك B بكار می رود.

مقایسه توالی نوكلئوتیدی SLT-II نیز در اشریشیاكلی با SLT-I نشان می دهد كه در مشابهت توالی نوكلئوتیدها ژنهای ساختمانی برای دوتوكسین در تحت واحد A 57% و در تحت واحد B، 60% می باشد (34).

همچنان كه قبلا گفته شد در گروه دوم SLT چندین نوع SLT-II وجود دارد و ژنهای هر كدام از آنها نیز مطالعه شده و با سایر SLTها مقایسه گردیده است ولی برای جلوگیری از طولانی شدن مبحث از توضیح آنها خودداری می گردد.

3-1-2 ساختمان وروتوكسین ها

ساختمان تحت واحدهای SLT بخاطر مشابهت آن با توكسین شیگا براحتی مطالعه شده و ساختار آن كاملا مشخص شده است كه به كمك اطلاعات بدست آمده از توالی نوكلئوتیدها و همچنین خالص سازی توكسین این امر میسر گردیده است. SLTها از دو تحت واحد تشكیل شده اند كه تحت واحد A  تقریبا 33 كیلودالتون و تحت واحدB حدود 5/7 كیلودالتون وزن دارد. تعداد تحت واحد B مشابه توكسین شیگا 5 تا بوده و در اتصالSLT به رسپتور گلیكولیپیدی نقش دارد.

از نظر فعالیت بیولوژی، تمامی وروتوكسین ها برای سلول های ورو (Vero) سمی بوده و برای موش كشنده اند همچنین برای خرگوش آنتروتوكسیک اند این توكسین مانع از سنتز پروتئین شده و كمتر از یک ساعت بعد از در معرض قرار گرفتن سلول، قابل تشخیص است.  وروتوكسین ها برای سلول های اندوتلیال عروقی نیز سمی بوده و علائمی كه در بیماری بروز می كند مربوط به تاثیر توكسین برروی این بافت ها است.

موشی كه مورد تزریق این توكسین قرار گیرد قبل از مرگ، دچار فلجی اندام خلفی می شود كه این حالت احتمالا بعلت آسیب به سیستم اعصاب مركزی است كه بعدا منجر به مرگ حیوان می گردد.  در خرگوش و خوك نیز كانون های گسترده هموراژی در عروق وادم مغزی دیده می شود كه در اثر SLT ایجاد شده و ضایعات مغزی منجر به مرگ حیوان می شود (20).

از نظر مكانیسم عمل،‌هر دو توكسین SLT-I و SLT-II در نتیجه فعالیت N-RNA گلیكوزیدازی مانع از سنتز پروتئین در سلول های اكاریوت می گردند. وروتوكسین ها باعث شكستن پیوند خاص N- گلیكوزیدی در RNA ریبوزمی s28 شده و در نتیجه آن یک باقیمانده آدنینی آزاد می شود و در نهایت سنتز پروتئینی صورت نمی گیرد.

اورمی همولیتیک با علائمی نظیر ناتوانی حاد كلیوی[18] ، ترمبوسیتوپنی[19] و آنمی همولیتیك[20] و اسهال توام است.